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In diesem Blogpost wollten wir einige der möglichen Ursachen hervorheben, die zu einer Mutagenese, die auf eine Debug-Site gerichtet ist, ohne den Nutzen einer Mutation führen können, und dann einige ebenso mögliche Lösungen vorschlagen. die Sie verwenden können, um das Problem zu beheben.Die ortsgerichtete Mutagenese (SDM) ist eine besondere Technik zur Erzeugung spezifischer und gezielter Unterschiede, die in doppelsträngiger Plasmid-DNA leben. Es gibt viele Gründe für die Durchführung außergewöhnlicher DNA-Modifikationen (Einfügungen, Deletionen, möglicherweise Substitutionen), einschließlich: Um Veränderungen bei der körperlichen Betätigung von gesundem Protein zu untersuchen, die als Teil der DNA-Manipulation auftreten.
Wie es leider bei vielen Berichten der Fall sein sollte, funktioniert Site-Directed Mutagenesis (SDM) fast immer anders als beim ersten Mal. Werfen wir einen Blick auf einige der Herausforderungen und Fakten zur ortsgerichteten Mutagenese, um dieses Unternehmen zu überwinden.
- Sie haben zu viele Siedlungen.
- Keine Zahlungen erhalten.
- Erhaltene Kolonien, die erfahrungsgemäß nicht die gewünschte Mutation enthalten müssen.
Die wichtigste ortsgerichtete Mutagenese, die ich Ihnen anbieten kann, besteht darin, dass Sie häufig, immer, immer Kontrollnebenwirkungen um Ihre SDM-Reaktionen herum ausüben! Viele Kits werden aus Komponenten zusammengestellt, die Sie benötigen, um technologische Reaktionen parallel zu Ihren persönlichen experimentellen Reaktionen auf das vorgeschlagene durchzuführen. Mithilfe dieser Pausen können Sie feststellen, wo Ihr Protokoll schief läuft, und ihnen auf lange Sicht Reagenzienzeit sparen.
Hier sind einige gezielte Mutagenese-Tipps, um wieder auf den richtigen Weg zu kommen, bevor Sie versuchen, eine solche korrekte und nervige Reaktion zu beheben!
Tipps zur Fehlerbehebung bei ortsorientierter Mutagenese
Wie sicher können Sie Site-directed Mutagenesis beheben?
Wenn Sie ziemlich viele Kolonien haben.Wenn Sie keine Zahlungen erhalten.Kolonien, die ohne die gewünschte Mutation typisieren.Immer nichts?Machen Sie so wenig Fortschritte wie möglich.Achte auf Symmetrie.Behalten Sie den GC-Gehalt bei ungefähr 50 %
Wenn Sie zu viele Kolonien haben
- Reduzieren Sie die Konzentration der in der PCR-Reaktion verwendeten Template-DNA.
- Reduzieren Sie die gesamte Menge an PCR-Produkt, die bei der Konvertierung verwendet wird.
- Multi-End CupsDurch Zentrieren der transformierten Einbauten (zB 10 µl Fertigbakterien, µl, 16, 50 µl, 100 µl) und sammeln Sie die Bienenstöcke nur von der Platte mit gut verteilten Kolonien.
- Erhöhen Sie die Verdauungszeit von DpnI (zum Beispiel 2 Stunden von 1 Stunde).
Wenn Sie keine Siedlungen erobern
- Erhöhen Sie die Menge an Template-DNA einer Person, die in der PCR-Reaktion verwendet wird.
- Erhöhen Sie die Anzahl der PCR-Ergänzungen, die Sie normalerweise bei der Verarbeitung verwenden.
- Versuchen Sie, einen Temperaturgradienten einzustellen – viele Computerhardware ist wahrscheinlich so konfiguriert, dass sie bei einer Vielzahl von Temperaturen arbeitet, indem sie kontrolliert heruntergefahren wird, während das Programm läuft. Probieren Sie einfach 3-4 verschiedene Temperaturen aus und optimieren Sie von dort aus.
- Versuchen Sie zum Beispiel, die Temperatur oder die Wachstumszeit zu ändern. Verringern Sie die Temperatur des Datenformats auf achtundsechzig ° C und erhöhen Sie sie auf 60 Sekunden oder kb.A
- fügen Sie etwas DMSO (2-8%) hinzu, um die Basenpaarung zu beeinflussen und die Strangtrennung in zahlreichen Bereichen des GC zu erhöhen.
- Überprüfen Sie mit einer Manipulationstransformation, ob die tatsächlich kompetenten Zellen normal funktionieren.
- Ethanol präzipitiert die absorbierte DNA und resuspendiert sie aus einer geringeren Dicke vor der Verarbeitung. Nach oben
- Vor der Transformation einfach die DNA-Probe aus Salz und anderen nach der PCR-Reaktion verbleibenden Punkten.
- MgCl 2 erhöhen.
Kolonien, die sich ohne die gewünschte Mutation bilden
- Verwenden Sie Methylase E. Impact Dam. coli, um ein Musterplasmid wie JM109 oder DH5alpha herzustellen.
- Erhöhen Sie die DpnI-Aufschlusszeit (z.B. 2 m Länge von 1 Stunde) oder erhöhen Sie die verwendete DpnI-Menge (aber die Art von DpnI kann die Kosten Ihres Experiments erhöhen!).
- Plotten Sie mehrere Konzentrationen einer beliebigen transformierten Suspension (z.B. zehn µl in Bakterienpräparat, µl, 20, 60 µl, 100 µl) und wählen Sie nur Städte aus der Hauptplatte mit gut verteilten Kolonien aus.
- Reduzieren Sie die Gesamtzahl der PCR-Zyklen.
Immer noch nichts?
Neues Design der idealen Basis
Wie bereits erwähnt, müssen ortsgerichtete Mutagenese-Primer normalerweise etwa 30 bp lang sein, wobei jede Stelle so nah wie möglich mutiert ist. sich auf jede Seite beziehen.
Nutzen Sie die unglaubliche Anzahl an Möglichkeiten
Um beispielsweise Serin mit Alanin zu reparieren, beginnend am UCA-Codon, ändern Sie es so, dass Sie GCA (1 Änderung) anstelle von GCU (2 Änderungen) haben.
Strebe nach Symmetrie
Halten Sie die mit Ihrem Abschnitt verknüpften Interessen so nah wie möglich in der Mitte des Anführers.
Halten Sie etwa 50 % des GC-Inhalts
In einigen Ländern ist dies einfacher als in anderen, wenn Sie sich nicht sicher sind, ob Sie einen höheren GC-Wert als einen niedrigeren GC-Wert anstreben, da wir die Einstellung für die PCR-Übelkeit eher an Temperaturänderungen anpassen. höhere GC erfordert normalerweise – es wird Inhalt geben.
Starten und beenden Sie das Tutorial mit einem G- oder C-Match
G bindet an höher bewertete C-Substrate als T oder A, daher hilft ein GG- oder CC-Primer bei der anfänglichen Bindung. Wenn Sie GG nicht an beiden Enden positionieren können, versuchen Sie, GG auf einer Seite und G auf der anderen Seite zu positionieren.
Achtung: nicht mit GG beginnen und nicht mit -geschlossenem Kreislauf enden, Sie werden am Ende selbstklebende Grundierungen auftragen!
Mehrere Websites deaktivieren?
Wenn bestimmte Stellen nahe beieinander liegen, ziehen Sie in Betracht, überlappende, wahrscheinlich überlappende Primer zu verwenden, aber stellen Sie sicher, dass die Stellen aufgrund beider Primersätze mutiert sind.
Was sind vielleicht die besten Tipps zur gezielten Mutagenese, um eine komplexe Mutation zu bekämpfen? Lassen Sie es uns in den folgenden Aussagen wissen!
Ursprünglich veröffentlicht am 5. Juli 2016 Überarbeitet und aktualisiert am 27. November 2020
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Ich habe vier Monate lang mutagenisiert, möchte aber noch keine mutierten Plasmide erhalten.
Der mit Ziel und Gen pBS (2,9 kb) verwandte Vektor ist 651 bp groß, dieses gemeinsame Gen ist normalerweise definitiv etwa 3,5 kb groß. Versuchte mehrere Bedingungen:
1. Gebraucht
94 ™ -> nur min.
94–> 30 Sek.
67 ° C 30 5 ° C Unternehmen. ( Plasmid 72 °C 2 Minuten / kbp (also für mein Plasmid 7,5 min) 23 fünf Zyklen 72 ° C, nicht 10 min sah DNA hoch auf dem Gel (0,8%) < p> Ich habe überhaupt keine Ahnung, wie es sein wird. > sd arv1 codng
Ich muss Sie dazu bringen, drei Mutationen zu entwerfen
Primer-Set1 (Tm = 72. OC ) –
Ein halbes Dutzend voraus ä: 5 ‘CAATATACGAAAGCATATCGGCcCTTGTTACTGAATACCAACAATCC 3’
Zurück: 5 ‘GGATTGTTGGTATTCAGTAACAAGgGCCGATATGCTTCGTATATTG 3CT
3Price 1.9 GACG Tm) = 7 1.9 GACG Tm) p>
Weiterleiten: 5 ‘CGGTATACGCCTAACAAATTcTGGGAAACCTGTAGATGC 3’TGGGAAACCTGTAGATGC 3’TGTGAT 
Rückwärts: 5′ GCATGATGAGGATGACT> Einmal
leider großgeschrieben ist, ist eine definitive Mutationsmenge
< p> Wenn Sie weitere inspirierende Punkte haben, sagen Sie es mir!
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Welches Mutagen kann sehr gut für die ortsgerichtete Mutagenese verwendet werden?
DNA-Polymerase: Das bedeutet, dass 5′- zu 3′-Exonukleasen hier einfach nicht wirken. DNA-Polymerasen wie Pfu, Vent bieten neben Phusion eine höhere Schallrate bei der ortsgerichteten Mutagenese. Taq-DNA-Polymerase wird auch nur in den meisten traditionellen PCR-basierten Methoden wie bei erweiterten Mutationen verwendet.
Wie werden diese gewünschten Mutationen bei der ortsgeschärften Mutagenese eingeführt?
Zusammenfassung einschließlich ortsgerichteter Mutagenese Kurz gesagt, Punktmutationen könnten leicht in Plazmide eingeführt werden, die unter Verwendung einer PCR-Diät, die das gesamte Template-Plasmid amplifiziert, Primer (mit der gewünschten Mutation) gewinnen. In Wirklichkeit werden aus den resultierenden Kolonien Plasmide isoliert, um sie dann auf die gewünschte Modifikation zu überprüfen.
Site Directed Mutagenesis Troubleshooting No Mutation
Rozwiazywanie Problemow Z Mutageneza Ukierunkowana Na Miejsce Bez Mutacji
Mutagenesi Sito Diretta Risoluzione Dei Problemi Nessuna Mutazione
Site Directed Mutagenese Probleemoplossing Geen Mutatie
사이트 지정 돌연변이 발생 문제 해결 돌연변이 없음
Ustranenie Problem S Sajt Napravlennym Mutagenezom Bez Mutacij
Mutagenese Dirigida Ao Local Sem Solucao De Mutacao
Mutagenesis Dirigida Al Sitio Resolucion De Problemas Sin Mutacion
Mutagenese Dirigee Depannage Aucune Mutation
Platsstyrd Mutagenes Felsokning Ingen Mutation
