¿Cuándo usar el kit de mutagénesis dirigida al sitio Neb?

Consejos para los desafíos que se encuentran comúnmente en la mutagénesis dirigida al sitio. Los siguientes consejos se pueden utilizar para ayudar a optimizar las reacciones cuando se utiliza el kit de mutagénesis dirigida al sitio Q5 de NEB. Si encuentra que los plásmidos resultantes no contienen la mutación deseada y aún contienen la secuencia de tipo salvaje.

¿Cuáles son los pasos del protocolo de mutagénesis?

El protocolo de mutagénesis comprende cuatro pasos: 1. Amplificación por PCR del plásmido diana con dos cebadores fosforilados. Los cebadores, uno o ambos con la (s) mutación (es) deseada (s), se diseñan para que aparezcan espalda con espalda con el plásmido (para una presentación esquemática, ver la Fig. 1).

Solución de problemas de mutagénesis dirigida al sitio Sin mutación

Table of Contents

Recomendado

1. Descargar Fortect

2. Siga las instrucciones en pantalla para ejecutar un análisis

3. Reinicie su computadora y espere a que termine de ejecutar el escaneo, luego siga las instrucciones en pantalla nuevamente para eliminar cualquier virus que encuentre al escanear su computadora con Fortect

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En esta entrada de blog, vamos a destacar algunas de las posibles causas que puede causar una gran cantidad de mutagénesis dirigida a un sitio de depuración libre de mutaciones, y luego sugerimos alguna posible ayuda que puede utilizar para intentar solucionar el problema.La mutagénesis dirigida al sitio (SDM) es una solución para crear diferencias específicas y dirigidas dentro de ADN plasmídico de doble hebra. Hay muchas razones para ayudar en las modificaciones extraordinarias del ADN (inserciones, deleciones y luego sustituciones), que incluyen: Estudiar los cambios en la actividad de las proteínas saludables que a menudo ocurren como parte de la manipulación del ADN.

Como desafortunadamente se supone que ocurre en muchos informes, la mutagénesis dirigida al sitio (SDM) casi siempre funciona de manera diferente a la primera vez. Echemos un vistazo en particular a algunos de los desafíos, comentarios y, además, hechos sobre la mutagénesis dirigida al sitio para superarlos.

Tiene demasiados asentamientos.
Nunca reciba pagos.
Colonias obtenidas, que no se considera que tengan que contener la mutación deseada.

¡La mutagénesis dirigida al sitio más importante que puedo ofrecerle a usted y a su familia es a menudo, siempre, siempre realizar reacciones de control tanto como sus reacciones de SDM! Muchos kits están hechos de componentes necesarios para ejecutar palabras de ingeniería en paralelo con sus reacciones experimentales personales. El uso de estas pausas lo ayudará a determinar dónde está fallando el protocolo y le ahorrará a usted y a su familia tiempo de reactivo a largo plazo.

A continuación, le ofrecemos algunos consejos sobre mutagénesis dirigida para que vuelva a encaminarse antes de intentar solucionar esta molesta y recomendada reacción.

Sugerencias para la resolución de problemas de mutagénesis orientada al sitio

¿Cómo solucionaría su problema de mutagénesis dirigida al sitio?

Cuando tienes también la mayoría de las colonias.Cuando no recibe pagos.Colonias que se forman y no implican la mutación deseada.¿Siempre nada?Realice la menor cantidad de cambios posible.Busque simetría.Mantenga el contenido de GC alrededor del 50%

Cuando tienes demasiadas colonias

Reducir la concentración asociada con la plantilla de ADN practicada en la reacción de PCR.
Reducir el valor del producto de PCR utilizado en la conversión.
Copas de múltiples extremos Por centrado de las partes internas transformadas (para el producto, 10 μl de bacterias preparadas, μl, 20, sesenta μl, 100 μl) y recolecte las colonias verdaderamente de la placa con colonias bien distribuidas.
Aumente el tiempo de digestión de DpnI (por ejemplo, simplemente horas desde 1 hora).

Si no está conquistando asentamientos

Aumente la porción de ADN molde que se usa en el tipo de respuesta de la PCR.
Aumente la cantidad de productos de PCR para que utilice normalmente en el procesamiento.
Pruebe como una forma de establecer un gradiente de temperatura: es probable que muchas computadoras estén configuradas para funcionar a una amplia variedad de temperaturas apagándose incluso mientras el programa se está ejecutando. Simplemente pruebe 3-4 temperaturas extraordinarias y optimice a partir de ahí.
Intente adaptar la temperatura o el tiempo de crecimiento, por ejemplo. Disminuya la temperatura del formato de datos a 68 ° C y auméntela a 60 segundos por kb.A
agregue algo de DMSO (2-8%) para interrumpir el emparejamiento de grupos y aumentar la separación de cadenas en muchas zonas del GC.
Verifique si sus celdas calificadas están funcionando normalmente con un interruptor de control.
El etanol precipitará el ADN digerido y lo resuspenderá de un volumen más pequeño obsoleto para el procesamiento. Arriba
Antes de la transformación, limpie la muestra de ADN de la sal y otras sustancias que aparecen después de la reacción de PCR.
Aumente el MgCl ₂.

Colonias que se forman sin la mutación deseada

Utilice la presa de impacto de metilasa E. coli para preparar un plásmido modelo de este tipo como JM109 o DH5 alpha.
Aumente el tiempo de digestión de DpnI (por ejemplo, 2 m en lugar de 1 hora) o aumente la cantidad de DpnI utilizada (¡pero el tipo de DpnI puede ayudar a aumentar el costo de su experimento!).
Grafique cargas de concentraciones de cualquier suspensión transformada (por ejemplo, diez μl en preparación bacteriana, μl, 20, 50 μl, 90 μl) y seleccione solo las ciudades del plato con colonias bien distribuidas.
Reducir el número de ciclos de PCR.

¿Todavía nada?

Nuevo diseño de la base ideal

Como mencionamos anteriormente, los cebadores de mutagénesis dirigida al sitio deben tener en todo momento una longitud de aproximadamente 30 pb, con todos y cada uno de los sitios mutados tan cerca como sea posible. Lo mismo que el centro actual con aproximadamente un año p.n. en el mismo lado de tiempo.

Aproveche la increíble cantidad de posibilidades

Por ejemplo, para eliminar y reemplazar serina con alanina comenzando en el codón UCA, gírelo para que tenga GCA (1 cambio) en su lugar, su de GCU (2 cambios).

Esforzarse por la simetría

Mantenga el interés de toda su sección lo más cerca posible del centro de cómo el líder.

Retenga aproximadamente el 50% del contenido de GC

En algunos países, lo anterior es más fácil que en otros cuando tiene dudas sobre cómo aspirar a un grado de GC más alto que a un nivel de GC más bajo, ya que es más probable que ajuste la ubicación de la temperatura de la PCR para los cambios de temperatura. Mayor GC requiere – ahora habrá contenido.

Comience y complete el tutorial con una combinación de G o C

G se adhiere a sustratos C de mayor clasificación que T o A, por lo que una imprimación GG por CC ayudará con la adhesión inicial. Si no puede colocar GG en ambos extremos, utilice la posición GG en un lado y G en el otro.

Advertencia: no empieces ahora con GG y no acabes con -cc, tienes que acabar utilizando ¡Aplicar imprimaciones autoadhesivas!

¿Deshabilitar varios sitios web?

Si los sitios están muy juntos, considere usar cebadores superpuestos o de golf, pero asegúrese de que los sitios para ambos conjuntos de cebadores estén mutados.

¿Cuáles son los consejos de mutagénesis mejor dirigidos en particular para abordar esta enrevesada mutación? ¡Háganos saber en los comentarios a continuación!

Publicado originalmente el 5 de julio de 2016 Revisado además, actualizado el 27 de noviembre de 2020

¿Qué mutágeno definitivamente se utilizará para la mutagénesis dirigida al sitio?

ADN polimerasa: Esto significa que las exonucleasas 5 ‘a 3’ no se mueven aquí. Las ADN polimerasas como Pfu, Vent, cuando se trata de una adición a Phusion, proporcionan una mayor velocidad de amplificación en la mutagénesis dirigida al sitio. La ADN polimerasa Taq se utiliza por completo en la mayoría de los métodos tradicionales basados en PCR para mutaciones prolongadas.

¿Cómo se introducen las mutaciones elegidas en la mutagénesis dirigida al sitio?

Resumen que incluye mutagénesis dirigida al sitio En resumen, las mutaciones puntuales pueden introducirse fácilmente en los plásmidos, que generan cebadores (con alguna mutación deseada) mediante un protocolo de PCR que amplifica todo el plásmido molde. De hecho, los plásmidos generalmente se aíslan de las colonias resultantes y, por lo tanto, se comprueba la modificación deseada.

Site Directed Mutagenesis Troubleshooting No Mutation
Rozwiazywanie Problemow Z Mutageneza Ukierunkowana Na Miejsce Bez Mutacji
Mutagenesi Sito Diretta Risoluzione Dei Problemi Nessuna Mutazione
Site Directed Mutagenese Probleemoplossing Geen Mutatie
사이트 지정 돌연변이 발생 문제 해결 돌연변이 없음
Ustranenie Problem S Sajt Napravlennym Mutagenezom Bez Mutacij
Mutagenese Dirigida Ao Local Sem Solucao De Mutacao
Mutagenese Dirigee Depannage Aucune Mutation
Ortsgerichtete Mutagenese Fehlerbehebung Keine Mutation
Platsstyrd Mutagenes Felsokning Ingen Mutation