Risolto: Esattamente Per Correggere L’errore Della Mutagenesi Sito-diretta A Meno Che Tu Non Abbia Una Mutazione.

 

Consigliato

1. Scarica Fortect

2. Segui le istruzioni sullo schermo per eseguire una scansione

3. Riavvia il computer e attendi che termini l'esecuzione della scansione, quindi segui nuovamente le istruzioni sullo schermo per rimuovere eventuali virus rilevati eseguendo la scansione del computer con Fortect

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In questo post del blog, siamo certi di evidenziare alcune delle potenziali cause che a sua volta può causare la mutagenesi diretta a un sito di debug senza necessità di mutazione, e quindi suggerire alcune possibili selezioni che puoi usare per provare ad allegare il problema.La mutagenesi sito-diretta (SDM) è un modo per creare differenze specifiche e mirate in tutto il DNA plasmidico a doppio filamento. Ci sono molte ragioni per fornire modifiche straordinarie del DNA (inserimenti, delezioni, poi sostituzioni), consiste in: Studiare i cambiamenti nell’attività delle proteine ​​sane che spesso si verificano come parte della manipolazione del DNA.

 

 

Come purtroppo dovrebbe essere in tanti rapporti, la mutagenesi sito-diretta (SDM) funziona quasi sempre in modo diverso rispetto alla prima volta. Diamo uno sguardo funzionale ad alcune delle sfide, dei commenti e semplicemente dei fatti sulla mutagenesi sito-diretta per superarli.

• Hai troppi insediamenti.
• Di certo non ricevi pagamenti.
• Colonie ottenute, che indubbiamente devono contenere la mutazione desiderata.

La mutagenesi sito-diretta più importante che posso offrire agli acquirenti è spesso, sempre, sempre eseguire reazioni di controllo vicine alle tue reazioni SDM! Molti kit sono realizzati al massimo livello di componenti necessari per realizzare risposte ingegneristiche in parallelo con le tue reazioni sperimentali personali. L’uso di queste pause ti aiuterà a determinare dove il tuo protocollo familiare sta andando male e a risparmiare tempo di reagente nel lungo periodo.

Ecco alcuni suggerimenti mirati sulla mutagenesi per riportarti indietro sulla strada giusta prima di provare a risolvere questa reazione accurata e fastidiosa!

Suggerimenti per la risoluzione dei problemi per la mutagenesi orientata al sito

Quando hai troppe colonie

• Ridurre la concentrazione associata al DNA stampo posto nella reazione PCR.
• Riduci l’importo in dollari del prodotto PCR utilizzato nella conversione.
• Tazze multi-endCentrando gli interni trasformati (per il modello, 10 μl di batteri pronti, μl, 20, cinquantacinque μl, 100 μl) e raccogliere le colonie una dalla piastra con colonie ben distribuite.
• Aumentare il tempo di digestione di DpnI (ad esempio, non una ma due ore da 1 ora).

Se non stai conquistando gli insediamenti

• Aumenta il denaro del DNA stampo utilizzato nell’effetto PCR.
• Aumentare il numero di prodotti PCR normalmente utilizzati durante l’elaborazione.
• Prova a impostare correttamente un gradiente di temperatura: è probabile che molti computer siano configurati per funzionare a una grande varietà di temperature spegnendosi quando il programma è in esecuzione. Basta provare 3-4 diversi tipi di temperature e ottimizzare da lì.
• Prova a cambiare la temperatura o il tempo di crescita, ad esempio. Diminuire la temperatura del formato dati a 68 °C e aumentarla a 60 secondi kb.A
• aggiungere un po’ di DMSO (2-8%) per interrompere l’accoppiamento e aumentare la separazione dei filamenti in molti materiali del GC.
• Controlla se le tue celle accreditate funzionano normalmente con una vendita di controllo.
• L’etanolo farà precipitare il DNA digerito e lo risospenderà da un volume più piccolo passato all’elaborazione. In alto
• Prima della trasformazione, eliminare un particolare campione di DNA dal sale e da altre sostanze che si trovano realmente dopo la reazione PCR.
• Aumenta MgCl ₂ .

Colonie che si formano senza la mutazione desiderata

• Utilizzare Methylase E. Impact Dam. coli per preparare un plasmide modello come JM109 o DH5 alpha.
• Aumenta il tempo di digestione DpnI (es. 2m invece di circa 1 ora) o aumenta la quantità di DpnI utilizzata (ma il tipo di DpnI può ottimizzare il costo del tuo esperimento!).
• Tracciare alcune concentrazioni di qualsiasi sospensione trasformata (ad esempio dieci μl nella preparazione batterica, μl, 20, 50 μl, una persona cento μl) e selezionare solo città dalla targa con colonie ben distribuite.
• Ridurre il numero di cicli PCR associati.

Ancora niente?

Nuovo Design Della Base Ideale

Come accennato in precedenza, i primer di mutagenesi sito-diretta dovrebbero avere una lunghezza di circa 30 bp, con quasi un sito mutato il più vicino possibile. lo stesso al centro con circa un anno p.n. su ogni lato.

Approfitta dell’incredibile numero di possibilità

Ad esempio, per rimuovere la serina con alanina a partire dal codone UCA, sostituiscilo in modo da avere GCA (1 cambio) in aggiunta a GCU (2 cambi).

Lotta per la simmetria

Mantieni l’interesse della tua sezione attuale il più vicino possibile al centro di un leader.

Conserva circa il 50% dei contenuti GC

In alcuni paesi quanto sopra è più facile di altri quando si ha il dubbio di puntare a una parte GC più alta rispetto a un livello GC più basso, poiché normalmente è più probabile che si regoli la temperatura della PCR per i cambiamenti di temperatura. CG più elevato richiede – a tale riguardo ci sarà contenuto.

Inizia e completa il tutorial con una corrispondenza G o C

G si lega a substrati C con rating più elevato rispetto a T o A, quindi un GG insieme a un primer CC aiuterà con l’adesione iniziale. Se non riesci a posizionare GG ad entrambe le estremità, dovresti provare a posizionare GG su un lato e G dopo l’altro.

Attenzione: non iniziare con GG e non finire con -cc, qualcuno finirà per usare Applica primer autoadesivi!

Disabilitare più siti web?

Se i negozi sono vicini, prendi in considerazione l’uso della sovrapposizione o dei primer, ma assicurati che i siti per entrambi i set di primer siano mutati.

Quali sono alcuni dei migliori consigli sulla mutagenesi mirata per affrontare questa mutazione brevettata? Fatecelo sapere nei commenti continuate a leggere!

Pubblicato originariamente il 5 luglio 2016 Rivisto ma aggiornato il 27 novembre 2020

Sto mutagenizzando da quattro mesi, ma non ho ancora bisogno di ricevere plasmidi mutati.

Il target e il gene pBS (2.9kb) del mio nuovo vettore è 651bp, questo gene comune è in realtà di circa 3.5kb. Ho provato diverse condizioni:

una sola. Usato

94 ™ -> 2 minimo.

94–> 30 sec.

55°C 30 5°C sec. (

Plasmide 72°C 2 min contro kbp (quindi per il mio plasmide 7,5 min) venticinque cicli

72 ° C, non 10 min

ha visto il DNA sui gel per la pelle (0,8%)

< p> Non ho novità su come sarà.

> sd arv1 codng

Ho bisogno di qualcuno per progettare tre mutazioni

Primer-Set1 (Tm = 72. OC) –

Metà ogni dozzina avanti д: 5 ‘CATATACGAAAGCATATCGGCcCTTGTTACTGAATACCAACAATCC 3’

Indietro: 5 ‘GGATTGTTGGTATTCAGTAACAAGgGCCGATATGCTTTCGTATATTG 3CT

3Prezzo GACG Tm> – Avanti: 5 ‘CGGTATACGCCTAACAAATTcTGGGAAACCTGTAGATGC 3’TGGGAAACCTGTAGATGC 3’TGTGAT

Indietro: 5′ GCATGATGAGGATGACT> Una volta 3 ‘che

tuttavia maiuscola è un’area di mutazione definita

Se hai altre idee ispiratrici, dimmelo!

 

 

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Site Directed Mutagenesis Troubleshooting No Mutation
Rozwiazywanie Problemow Z Mutageneza Ukierunkowana Na Miejsce Bez Mutacji
Site Directed Mutagenese Probleemoplossing Geen Mutatie
사이트 지정 돌연변이 발생 문제 해결 돌연변이 없음
Ustranenie Problem S Sajt Napravlennym Mutagenezom Bez Mutacij
Mutagenese Dirigida Ao Local Sem Solucao De Mutacao
Mutagenesis Dirigida Al Sitio Resolucion De Problemas Sin Mutacion
Mutagenese Dirigee Depannage Aucune Mutation
Ortsgerichtete Mutagenese Fehlerbehebung Keine Mutation
Platsstyrd Mutagenes Felsokning Ingen Mutation