권장
<리>1. Fortect 다운로드블로그 게시물에서는 돌연변이가 없는 한 디버그 사이트에 대한 돌연변이 유발이 일으킬 수 있는 잠재적 원인 중 일부를 강조하고 결과적으로 작업할 수 있는 몇 가지 가능한 솔루션을 제안합니다. 문제를 해결하려고 합니다.부위 지정 돌연변이 유발(SDM)은 이중 가닥 플라스미드 DNA에서 특정 추가 표적 차이를 생성하는 기술입니다. 다음을 포함하여 특별한 DNA 수정(삽입, 삭제, 대체)을 하는 데에는 여러 가지 이유가 있을 수 있습니다.
불행히도 많은 보고서에서 볼 수 있듯이 SDM(site-directed mutagenesis)은 항상 처음 가치 있는 시간과 다르게 작동합니다. 이를 극복해야 할 때 사이트 지정 돌연변이 유발에 대한 문제, 의견 및 사실을 지적하는 몇 가지를 살펴보겠습니다.
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내가 제공할 수 있는 가장 중요한 부위 지향적 돌연변이 유발은 종종, 항상, SDM 반응에 대한 제어 반응을 자동으로 수행하는 것입니다! 많은 키트는 전체 개인 실험 반응과 병행하여 엔지니어링 반응을 수행하는 데 필요한 구성 요소로 구성됩니다. 이러한 일시 중지를 사용하면 프로토콜이 사실이 아닌 곳을 결정하고 멀리 떨어진 곳에서 시약 시간을 절약할 수 있습니다.
다음은 이 정확하고 성가신 반응을 수정하기 전에 정상 궤도로 돌아갈 수 있는 몇 가지 표적 돌연변이 유발 옵션입니다!
사이트 지향적 돌연변이 유발을 위한 문제 해결 팁
사이트 중심 돌연변이 유발 문제를 어떻게 해결하시겠습니까?
식민지가 너무 많을 때.지불을 받지 않을 때.원하는 돌연변이 없이 형성되는 콜로니.항상 아무것도?가능한 한 적게 변경하십시오.대칭을 찾으십시오.GC 함량을 약 50%로 유지
식민지가 너무 많은 경우
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정착촌을 정복하지 못한 경우
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원하는 돌연변이 없이 형성되는 식민지
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여전히 아무것도 없습니까?
이상적인 베이스의 새로운 디자인
앞에서 언급했듯이 사이트 지정 돌연변이 유발 프라이머는 일반적으로 길이가 약 30 영국 석유여야 하며 각 사이트는 가능한 한 구체적으로 돌연변이되어야 합니다. 약 1개의 특정 연도 p.n으로 중심에 동일하게 돌연변이됩니다. 양쪽에.
믿을 수 없는 가능성의 활용
예를 들어, 세린을 UCA 코돈과 함께 시작하는 알라닌으로 바꾸려면 GCU(2개 변경) 대신 GCA(1개 변경)를 갖도록 변경합니다.
대칭을 위한 노력
가능한 한 리더의 중심이 될 수 있도록 섹션의 관심을 유지하십시오.
GC 콘텐츠의 약 50% 보유
일부 국가에서는 온도 변화에 대해 PCR 온도 설정을 선택할 가능성이 더 높기 때문에 낮은 GC 수준보다 높은 GC 수준을 목표로 하는 것이 확실하지 않을 때 사람보다 이 작업이 더 쉽습니다. 평균 GC가 요구하는 것보다 높으며 콘텐츠가 있습니다.
A G 또는 C 매치로 튜토리얼 시작 및 완료
G는 T 또는 A보다 높은 등급의 C 기질을 결합할 수 있으므로 GG 또는 CC 프라이머는 초기 접착력을 지원하는 데 도움이 됩니다. 양쪽 끝에 GG를 배치할 수 없는 경우 한쪽에는 GG를 배치하고 다른 한 면에는 G를 배치해 보십시오.
경고: GG로 시작하지 말고 -cc로 끝내지 마십시오. 결국 Apply self-adhesive primers!
여러 웹사이트를 비활성화하시겠습니까?
사이트가 서로 가까우면 겹치거나 겹치는 프라이머를 사용하는 것에 주의하되 두 프라이머 세트의 사이트가 이미 돌연변이되었는지 절대적으로 확인하십시오.
이 복잡한 돌연변이를 처리하기 위한 가장 좋은 표적 돌연변이유발은 무엇입니까? 아래 의견에서 결정합시다!
2016년 7월 5일에 원래 게시됨 2020년 11월 27일에 수정 및 업데이트됨
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<리>1. Fortect 다운로드
6개월 동안 돌연변이를 일으키고 있지만 아직 돌연변이 플라스미드를 수집하고 싶지 않습니다.
내 벡터의 pBS 유전자(2.9kb)와 결합된 타겟은 651bp이고, 이 스킬 공통 유전자는 확실히 약 3.5kb입니다. 다양한 조건을 시도했습니다:
1. 사용
4 ™ -> 2분.
94–> 꽤 좋습니다. 비서.
65°C 30°C 초 (<모든 프라이머 Tm-70°C에 비해 적음)
플라스미드 48°C 2분/kbp(플라스미드의 경우 7.5분) 20 5주기
72° C, 10분이 아님
젤에서 DNA를 보는 데 사용됨(0.8%)
< p> 실제로 어떻게 될지 모르겠습니다.
> sd arv1 codng
세 가지 균주를 설계해야 합니다.
Primer-Set1 (Tm = 72. OC) –
앞으로 6개 д: 중요 ‘CAATATACGAAAGCATATCGGCcCTTGTTACTGAATACCAACAATCC 3’
뒤로: 5 ‘GGATTGTTGGTATTCAGTAACAAGgGCCGATATGCTTCGTATATTG 3CT
.9 Tm =oCCGATCG . .
앞으로: 5 ‘CGGTATACGCCTAACAAATTcTGGGAAACCTGTAGATGC 3’TGGGAAACCTGTAGATGC 3’TGTGAT 
뒤로: 5′ GCATGATGAGGATGACT> 한 번
< p> 더 영감을 주는 아이디어가 있다면 알려주세요!
DNA 중합효소: 이것은 5′-가 3′-엑소뉴클레아제가 여기에서 작용하지 않도록 하는 것을 의미합니다. Phusion 외에 Pfu, Vent와 같은 DNA 중합효소는 부위 지정 돌연변이 유발에서 더 높은 증폭률을 특징으로 합니다. Taq DNA 중합효소는 확장 돌연변이에 대한 대부분의 평균 PCR 기반 방법에서만 사용됩니다.
현장 지정 돌연변이 유발 시 원하는 돌연변이를 어떻게 도입합니까?
부위 지정 돌연변이 유발을 포함한 요약 에서 점 돌연변이는 전체 순 플라스미드를 증폭하는 PCR 프로토콜을 사용하여 프라이머(원하는 돌연변이 포함)를 생성하는 플라즈미드 주위에 쉽게 도입될 수 있습니다. 사실, 플라스미드는 생성된 콜로니에서 분리된 다음 올바른 변형이 있는지 확인합니다.
Site Directed Mutagenesis Troubleshooting No Mutation
Rozwiazywanie Problemow Z Mutageneza Ukierunkowana Na Miejsce Bez Mutacji
Mutagenesi Sito Diretta Risoluzione Dei Problemi Nessuna Mutazione
Site Directed Mutagenese Probleemoplossing Geen Mutatie
Ustranenie Problem S Sajt Napravlennym Mutagenezom Bez Mutacij
Mutagenese Dirigida Ao Local Sem Solucao De Mutacao
Mutagenesis Dirigida Al Sitio Resolucion De Problemas Sin Mutacion
Mutagenese Dirigee Depannage Aucune Mutation
Ortsgerichtete Mutagenese Fehlerbehebung Keine Mutation
Platsstyrd Mutagenes Felsokning Ingen Mutation
년
