Corrigé : Comment Corriger Votre Erreur Actuelle De Mutagenèse Dirigée Sans Mutation.

 

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Dans cet article de blog sur les compétences, nous allons en souligner certaines avec les causes potentielles que la mutagenèse dirigée vers un autre site de débogage sans mutation peut provoquer, et suggérer quelques solutions possibles que vous pouvez aider pour essayer de régler le problème.La mutagenèse dirigée (SDM) est une technique permettant de créer des différences spécifiques supplémentaires ciblées dans l’ADN plasmidique double brin. Il existe incontestablement de nombreuses raisons de faire des transitions d’ADN extraordinaires (insertions, suppressions, puis substitutions), notamment : Pour étudier les changements sur l’activité des protéines saines qui se produisent dans le cadre de la manipulation de l’ADN.

 

 

Comme on le prétend malheureusement dans de nombreux rapports, la mutagenèse dirigée (SDM) fonctionne presque toujours différemment des premières minutes. Jetons un coup d’œil à certains de tous les défis, commentaires et faits sur la mutagenèse dirigée pour leur permettre de les surmonter.

• Vous avez un trop grand nombre de colonies.
• Ne pas recevoir de paiements.
• Colonies obtenues, qui ne doivent pas nécessairement contenir notre propre mutation souhaitée.

La mutagenèse dirigée la plus importante que je puisse vous offrir consiste souvent, toujours, presque toujours à effectuer des réactions de contrôle autour de vos réactions SDM ! De nombreux kits sont constitués de composants nécessaires pour effectuer des réactions d’ingénierie en parallèle avec toutes vos réactions expérimentales personnelles. L’utilisation de ces pauses vous aidera à déterminer où votre protocole ne va pas et vous fera gagner du temps pour les réactifs à grande échelle.

Voici quelques guides de mutagenèse ciblés pour vous remettre sur les rails avant de chercher à corriger cette réaction correcte et agaçante !

Conseils de dépannage pour la mutagenèse orientée site

Quand vous avez trop de colonies

• Réduisez la concentration associée en utilisant l’ADN matrice dans le résultat de la PCR.
• Réduire la quantité de produit PCR obtenu en conversion.
• Gobelets multi-emboutsPar centrage des internes transformés particuliers (par exemple, 10 l de bactéries prêtes à l’emploi, l, 20, 50 l, 100 l) ainsi que la collecte des colonies uniquement à partir de la plaque de bien répartie colonies.
• Augmenter le temps de digestion entre DpnI (par exemple, 2 heures à partir de 9 heures).

Si vous ne conquérez pas de colonies

• Augmentez la quantité d’ADN matrice consommée dans la réaction PCR.
• Augmentez le nombre de produits PCR que vous utilisez normalement en utilisant le traitement.
• Essayez de régler une inclinaison de température – de nombreux ordinateurs sont susceptibles d’être modifiés pour fonctionner dans une grande variété de climats en s’arrêtant pendant que le programme se déchaîne. Essayez simplement 3-4 températures différentes et optimisez à partir de là.
• Essayez de changer la température ou l’heure du jardinage, par exemple. Diminuez le format des données météo à 68°C et augmentez-le pour qu’il soit à 60 secondes/ko.A
• ajoutez un peu de DMSO (2-8%) pour perturber l’appariement des bases et augmenter la séparation des follicules dans de nombreuses zones du GC.
• Vérifiez si vos cellules compétentes fonctionnent fréquemment avec une transformation de contrôle.
• L’éthanol précipitera probablement l’ADN digéré et le remettra en suspension dans un plus petit volume avant le traitement. Haut
• Avant la transformation, effacez l’échantillon d’ADN de l’océan et des autres substances restantes après la réponse PCR.
• Augmenter MgCl ₂ .

Colonies qui se forment sans la mutation souhaitée

• Utilisez la méthylase E. Impact Dam. coli pour planifier un plasmide modèle tel que JM109 ou DH5alpha.
• Augmentez le point de digestion DpnI (par exemple 2m au lieu de 1 heure) ou renforcez la quantité de DpnI utilisée (mais l’écriture de DpnI peut augmenter le coût de l’expérience personnelle !).
• Tracer plusieurs concentrations de toute suspension tournée (par exemple 10 l dans la préparation bactérienne, l, 20, 50 l, 100 l) et sélectionner exclusivement les villes de la plaque avec des colonies bien réparties.
• Réduisez le nombre de cycles PCR.

Toujours rien ?

Nouveau design de la base idéale

Comme nous l’avons mentionné précédemment, les amorces de mutagenèse dirigée devraient généralement avoir une longueur d’environ 30 pressions artérielles, chaque site muté le plus près possible. Même au centre avec environ la nouvelle année p.n. de chaque côté.

Profitez du nombre incroyable de possibilités

Par exemple, pour remplacer la sérine par l’alanine en commençant par le codon UCA, modifiez-le afin que vous puissiez avoir GCA (1 changement) au lieu de GCU (2 changements).

Viser la symétrie

Gardez l’intérêt de votre section aussi proche que possible du centre du leader.

Détenir environ 50 % du contenu du GC

Dans certains pays, c’est plus facile que dans d’autres lorsque vous doutez de travailler avec un niveau de GC plus élevé qu’un niveau de GC inférieur, car vous êtes plus susceptible de modifier le réglage de la température PCR pour les changements de température. grand GC exige – il y aura du contenu.

Commencer et terminer le didacticiel avec une correspondance G ou C

G se lie avec des substrats C mieux notés que T ou A, donc un apprêt GG ou CC le permettra avec une adhérence initiale. Si vous ne pouvez pas positionner GG aux deux extrémités, essayez de positionner GG d’un seul côté et G de l’autre.

Attention : ne commencez pas par GG et ne terminez plus par -cc, vous finirez par utiliser Appliquer des apprêts auto-adhésifs !

Désactiver plusieurs sites Web ?

Si les sites sont proches les uns des autres, effectuez l’acquisition en utilisant des amorces qui se chevauchent ou qui se chevauchent, mais assurez-vous que les sites des deux ensembles d’amorces ont tendance à être mutés.

Quels sont les bons conseils de mutagenèse ciblée pour lutter contre cette mutation complexe ? Gardons à l’esprit dans les commentaires ci-dessous!

Publié initialement le 5 juillet 2016 Révisé et mis à jour le 27 novembre 2020

Je mute depuis quatre mois, mais je ne veux pas encore générer de plasmides mutés.

La cible en plus du gène pBS (2.9kb) de mon vecteur est 651bp, le gène commun particulier est certainement d’environ 3.5kb. J’ai essayé quelques conditions :

1. Utilisé

4 ™ -> 2 min.

94–> une demi-heure sec.

65 ° C 30 tous les cinq ° C sec. (

Plasmide 48°C 2 min/kpb (donc pour mon plasmide perso 7.5 min) 20 cinq cycles

48°C , pas 10 min

ADN découvert sur gel (0,8%)

< p> Je n’ai aucune idée de comment il va évoluer.

> sd arv1 codng

J’ai besoin de vous pour concevoir trois souches

Primer-Set1 (Tm = 72. OC) –

Une demi-douzaine d’avance д : un couple de ‘CAATATACGAAAGCATATCGGCcCTTGTTACTGAATACCAACAATCC 3’

Retour : 5′ GGATTGTTGGTATTCAGTAACAAGgGCCGATATGCTTTCGTATATTG 3CT

3Prix

Avant : 5′ CGGTATACGCCTAACAAATTcTGGGAAACCTGTAGATGC 3’TGGGAAACCTGTAGATGC 3’TGTGAT

En arrière : 5′ GCATGATGAGGATGACT> Une fois 3′ qui

​​

malheureusement en majuscule est tout type de point de mutation défini

Si vous possédez d’autres idées inspirantes, dites-le-moi !

 

 

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