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Na postagem do blog de ideias, vamos destacar algumas das possíveis causas que a mutagênese direcionada a praticamente qualquer site de depuração sem mutação pode causar, e você deve sugerir algumas soluções possíveis para você pode ser usado para tentar resolver o problema.A mutagênese dirigida ao local (SDM) é uma técnica para criar diferenças específicas ou direcionadas no DNA de plasmídeo de fita dupla. Existem muitas razões para fazer com que o DNA varie extraordinariamente (inserções, deleções e substituições), incluindo: Para estudar as mudanças durante a atividade protéica saudável que ocorrem como parte da manipulação do DNA.
Como infelizmente acontecerá em muitos relatórios, a mutagênese dirigida ao local (SDM) quase sempre funciona de maneira diferente do que o primeiro ponto. Vamos dar uma olhada em alguns itens relacionados aos desafios, comentários e fatos sobre a mutagênese dirigida ao local que você pode superar.
- Você tem muitos assentamentos.
- Não receba pagamentos.
- Colônias obtidas, que não precisam conter algumas das mutações desejadas.
A mutagênese dirigida ao local mais importante que posso oferecer é, com frequência, sempre, a execução consistente de reações de controle em torno de suas reações SDM! Muitos kits são compostos de componentes necessários quando você precisa realizar reações de engenharia em paralelo com as reações experimentais pessoais de sua empresa. O uso dessas pausas o ajudará a determinar onde seu protocolo está sendo mal orientado e a economizar tempo de reagente na execução considerável.
Aqui estão alguns fatores de mutagênese direcionados para colocá-lo de volta nos trilhos antes de tentar corrigir essa reação correta e irritante!
Dicas de solução de problemas para mutagênese orientada a sites
Como você solucionaria problemas de mutagênese inspirada em sites?
Quando você tem muitas colônias.Quando você não aproveita os pagamentos.Colônias que se formam sem a mutação desejada.Sempre nada?Tenha em mente o mínimo possível de alterações.Procure simetria.Manter o conteúdo de GC em torno de 50%
Quando você tem muitas colônias
- Reduza a concentração associada ao DNA modelo usado no tipo de reação de PCR.
- Reduza a quantidade de produto de PCR usado na conversão.
- Copos de múltiplas extremidades pela centralização do tipo de internos transformados (por exemplo, 10 μl de bactérias prontas, μl, 20, 50 μl, 100 μl) e, em seguida, coletar as colônias apenas da placa por ter uma distribuição bem distribuída colônias.
- Aumente o DpnI relacionado ao tempo de digestão (por exemplo, 2 horas a partir de 2 horas).
Se você não está conquistando acordos
- Aumente a quantidade de DNA modelo utilizado na reação de PCR.
- Aumente a quantidade de produtos de PCR que você normalmente usa apenas no processamento.
- Tente definir uma inclinação de temperatura – muitos computadores são provavelmente projetados para operar em uma ampla variedade de ambientes, desligando-se enquanto o programa está correndo em uma esteira. Experimente 3-4 temperaturas diferentes e otimize com elas.
- Tente alterar a temperatura ou hora de início, por exemplo. Diminua a umidade do formato de dados para 68 ° C e aumente-a para realmente 60 segundos / kb.A
- adicione um pouco de DMSO (2-8%) para interromper o emparelhamento de bases e aumentar a separação do folículo em muitas áreas do GC.
- Verifique se suas células competentes estão funcionando normalmente com uma transformação de controle.
- O etanol certamente precipita o DNA digerido e o ressuspende de um volume menor antes do processamento. Top
- Antes da transformação, limpe a amostra de DNA de substâncias marinhas e outras substâncias remanescentes após os resultados da PCR.
- Aumente o MgCl 2 .
Colônias que se formam sem a mutação desejada
- Use Metilase E. Impact Dam. coli para treinar um plasmídeo modelo, como JM109 ou DH5 alpha.
- Aumente os minutos de digestão DpnI (por exemplo, 2m em vez de 1 hora) ou estenda a quantidade de DpnI usada (mas a forma de DpnI pode aumentar o custo desse experimento!).
- Plote várias concentrações de qualquer suspensão substituída (por exemplo, 10 μl na preparação bacteriana, μl, 20, 50 μl, 100 μl) e selecione apenas cidades reais da placa com colônias bem distribuídas.
- Reduza o número de ciclos de PCR.
Ainda nada?
Novo design da base ideal
Como mencionamos anteriormente, os iniciadores de mutagênese dirigida ao local devem geralmente ter cerca de 30 petróleo britânico de comprimento, com cada local mutado o mais fechado possível. mesmo ao centro com cerca de um ano p.n. em cada lado.
Aproveite o incrível número de possibilidades
Por exemplo, para substituir serina por alanina começando em torno do códon UCA, altere-o para que os clientes tenham GCA (1 alteração) em vez de GCU (2 alterações).
Esforce-se pela simetria
Mantenha o interesse de sua seção o mais próximo possível para permitir que eles se posicionem no centro do líder possível.
Detém cerca de 50% do conteúdo GC
Em alguns países, isso é mais fácil do que em outras pessoas quando você está em dúvida se pretende um nível de GC mais alto do que um nível de GC mais baixo, pois é mais provável que você mude a configuração de temperatura do PCR para mudanças de temperatura. um GC significativamente maior requer – haverá conteúdo.
Comece e conclua o tutorial com uma correspondência G ou C
Ligações G que ajudarão substratos de classificação C mais alta do que T ou A, então um primer GG ou CC permitirá a adesão inicial. Se você não pode posicionar GG em ambas as extremidades, tente posicionar GG no lado do modelo e G no outro.
Atenção: não comece com GG e provavelmente não termine com -cc, você vai acabar fazendo uso de Aplicar primers autoadesivos!
Desativar vários sites?
Se os locais estiverem próximos, pense em usar primers sobrepostos ou sobrepostos, mas certifique-se de que os locais para ambos os conjuntos de primers já estão mutados.
Quais são os melhores conselhos de mutagênese direcionada para lidar com essa mutação complexa? Deixe-nos entender ou saber nos comentários abaixo!
Originalmente publicado em 5 de julho de 2016 Revisado e atualizado em 27 de novembro de 2020
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Estou fazendo mutagenização há cinco meses, mas não quero pegar os plasmídeos mutados ainda.
O alvo então gene pBS (2,9 kb) do meu vetor é 651 pb, certo gene comum é definitivamente cerca de 3,5 kb. Experimentei muitos tipos de condições:
1. Usado
ninety four ™ -> 2 min.
94–> 22 seg.
65 ° C 30 6 ° C seg. ( Plasmídeo setenta e dois ° C 2 min / kbp (então para alguns plasmídeos 7,5 min) 20 cinco ciclos 48 ° C, não 10 min DNA observado no gel (0,8%) Não tenho ideia de como isso vai se transformar. > codng sd arv1
Preciso que você projete três cepas
Primer-Set1 (Tm = 72. OC) –
Meia dúzia à frente д: importante ‘CAATATACGAAAGCATATCGGCcCTTGTTACTGAATACCAACAATCC 3’
Voltar: 5 ‘GGATTGTTGGTATTCAGTAACAAGgGCCGATATGCTTTCGTATATTTG 3CT = 71 GTAAC>
) p>
Avançar: 5 ‘CGGTATACGCCTAACAAATTcTGGGAAACCTGTAGATGC 3’TGGGAAACCTGTAGATGC 3’TGTGAT
Retroceder: 5 ‘GCATGATGAGGATGACT> Uma vez
infelizmente capitalizado é cada ponto de mutação definitivo
Se você tiver ideias mais inspiradoras, diga-me!
Qual mutagênico pode ser usado para mutagênese direcionada a loja virtual?
DNA polimerase: Isso significa que 5′- com 3′-exonucleases não agem aqui. Uma variedade de polimerases de DNA como Pfu, Vent, além de Phusion, fornecem uma taxa de amplificação mais alta na mutagênese dirigida ao local. A Taq DNA polimerase é usada apenas na maioria dos métodos tradicionais baseados em PCR para mutações estendidas.
Como as mutações desejadas são introduzidas a partir da mutagênese dirigida ao local?
Resumo incluindo mutagênese dirigida ao local No afinamento, as mutações pontuais podem ser facilmente introduzidas dentro de plazmids, que geram primers (com a mutação desejada) fazendo uso de um protocolo de PCR que amplifica todo o layout do plasmídeo. Na verdade, os plasmídeos são isolados inquestionavelmente das colônias resultantes e, em seguida, verificados quanto à modificação desejável.
Site Directed Mutagenesis Troubleshooting No Mutation
Rozwiazywanie Problemow Z Mutageneza Ukierunkowana Na Miejsce Bez Mutacji
Mutagenesi Sito Diretta Risoluzione Dei Problemi Nessuna Mutazione
Site Directed Mutagenese Probleemoplossing Geen Mutatie
사이트 지정 돌연변이 발생 문제 해결 돌연변이 없음
Ustranenie Problem S Sajt Napravlennym Mutagenezom Bez Mutacij
Mutagenesis Dirigida Al Sitio Resolucion De Problemas Sin Mutacion
Mutagenese Dirigee Depannage Aucune Mutation
Ortsgerichtete Mutagenese Fehlerbehebung Keine Mutation
Platsstyrd Mutagenes Felsokning Ingen Mutation
