Rekommenderas
I det här blogginlägget kommer vi att belysa några som oftast är förknippade med de möjliga orsakerna som mutagenes riktar till praktiskt taget alla felsökningsplatser utan mutation kan orsaka, och därför föreslår vi några möjliga lösningar som du kan börja använda för att försöka åtgärda problemet.Platsriktad mutagenes (SDM) är en teknik för att skapa specifika så riktade skillnader i dubbelsträngat plasmid-DNA. Det bör finnas många skäl för att göra extraordinär DNA -modifiering (insättningar, raderingar, sedan substitutioner), inklusive: Att studera förändringar medan hälsosam proteinaktivitet som uppstår som en del av DNA -manipulation.
Som man tyvärr tror i många rapporter fungerar platsstyrd mutagenes (SDM) praktiskt taget alltid annorlunda än det första ögonblicket. Låt oss ta en titt på några av utmaningarna, kommentarerna och fakta om platsriktad mutagenes för att övervinna dem.
- Du har för riktigt bosättningar.
- Ta inte emot betalningar.
- Kolonier erhållna, som inte behöver innehålla din önskade mutation.
Den viktigaste platsinriktade mutagenesen jag kan erbjuda dig är ofta, alltid, aldrig att utföra kontrollreaktioner kring dina SDM-reaktioner! Många kit består av komponenter som behövs för att utföra tekniska reaktioner parallellt med dina personliga personliga experimentella reaktioner. Att använda dessa pauser hjälper dig att avgöra var ditt protokoll går sönder och sparar dig reagenstid under den omfattande körningen.
Här är några riktade mutagenes -tankar för att få dig tillbaka på rätt spår innan du börjar fixa denna korrekta och irriterande reaktion!
Felsökningstips för platsorienterad mutagenes
Hur skulle du felsöka webbplatsrekommenderad mutagenes?
När du har för många kolonier.När du inte upptäcker betalningar.Kolonier som bildas utan den önskade mutationen.Alltid ingenting?Gör några få ändringar som möjligt.Leta efter symmetri.Behåll GC -innehållet runt 50%
När du har för många kolonier
- Minska koncentrationen som är associerad med mall -DNA som används i PCR -svaret.
- Minska mängden PCR -produkt som används vid konvertering.
- Koppar med flera ändar Genom centration av dess transformerade inre (till exempel 10 μl färdiga bakterier, μl, 20, 50 μl, 100 μl) samlas kolonierna endast från plattan genom välfördelade kolonier.
- Öka matsmältningstiden DpnI (till exempel 2 timmar från första timmen).
Om du inte erövrar bosättningar
- Öka mängden mall -DNA som konsumeras i PCR -reaktionen.
- Öka mängden PCR -produkter som du normalt använder under hela behandlingen.
- Försök att ställa in en temperaturlutning – många datorer kommer sannolikt att ställas in för att fungera i en mängd olika miljöer genom att stänga av medan programmet pågår. Testa bara 3-4 olika temperaturer och optimera där.
- Försök ändra temperaturen eller snabbväxttiden, till exempel. Minska dataformatets kroppstemperatur till 68 ° C och öka den till slutligen 60 sekunder / kb.A
- lägg till lite DMSO (2-8%) för att störa basparning och öka strängseparationen på många områden i GC.
- Kontrollera om dina kompetenta celler fungerar på ett naturligt sätt med en kontrollomvandling.
- Etanol skulle säkert fälla ut det smälta DNA: t och återsuspendera det efter en mindre volym före bearbetning. Överst
- Före transformation, rensa DNA -provet från natriumklorid och andra ämnen som återstår efter PCR -orsaken.
- Öka MgCl 2 .
Kolonier som bildas utan den önskade mutationen
- Använd metylas E. Impact Dam. coli för att växla upp en modellplasmid som JM109 eller DH5 alpha.
- Öka arbetstiden för DpnI -matsmältning (t.ex. 2 m istället för 1 timme) eller stärka mängden DpnI som används (men alternativet med DpnI kan öka kostnaden för ditt fantastiska experiment!).
- Plotta flera koncentrationer av eventuell vänd suspension (t.ex. 10 μl i bakteriell beredning, μl, 20, 50 μl, 100 μl) och välj slutgiltiga städer från plattan med väl fördelade kolonier.
- Minska antalet PCR -cykler.
Fortfarande ingenting?
Ny design av den perfekta basen
Som vi nämnde tidigare bör platsriktade mutagenesprimrar vanligtvis vara cirka 30 brittiska petroleumlängder, varvid varje plats muteras så identiskt som möjligt. samma till centrum med ungefär varje år p.n. på varje sida.
Dra fördel av det otroliga antalet möjligheter
Till exempel, för att ersätta serin med alanin som eventuellt börjar på UCA -kodon, ändra det så att du kan ha GCA (1 förändring) istället för GCU (2 ändringar).
Sträva efter symmetri
Håll intresset för din sektion så nära mitten av ledaren som möjligt.
Håll cirka 50% av GC -innehållet
I vissa länder är detta lättare än andra individer när du är i tvivel om att sikta på en högre GC-nivå än en lägre GC-nivå, eftersom du är mer benägna att finjustera PCR-temperaturinställningen för temperaturförändringar. mer förhöjd GC kräver – det kommer att finnas innehåll.
Starta och slutför självstudien med A G eller C Match
G -bindningar så att du kan få högre C -substrat än T eller A, så en GG- eller CC -primer hjälper dig med initial vidhäftning. Om du inte kan placera GG i båda ändarna, försök placera GG på en persons sida och G på den andra.
Varning: börja inte med GG och sluta inte med -cc, du kommer att använda användningen av självhäftande primers!
Inaktivera flera webbplatser?
Om platserna ligger nära varandra, fundera över med överlappande eller överlappande primers, men gör ja, sajterna för båda primerset kommer att muteras.
Vilka är de bästa riktade mutagenesförfarandena för att hantera denna komplexa mutation? Låt oss förstå i kommentarerna nedan!
Ursprungligen publicerad den 5 juli 2016 Reviderad och uppdaterad 27 november 2020
Rekommenderas
Körs din dator långsamt? Har du problem med att starta Windows? Misströsta inte! Fortect är lösningen för dig. Detta kraftfulla och lättanvända verktyg kommer att diagnostisera och reparera din dator, öka systemets prestanda, optimera minnet och förbättra säkerheten i processen. Så vänta inte - ladda ner Fortect idag!
Jag har mutageniserat i fyra olika månader, men jag vill inte få tag på muterade plasmider än.
Målet och dessutom genen pBS (2.9kb) för min vektor är 651bp, den faktiska vanliga genen är definitivt cirka 3.5kb. Provade ett bra antal villkor:
1. Använd
4 ™ -> 2 min.
94–> tjugo sekunder.
65 ° C 30 tekniker ° C sek. ( Plasmid sjuttiotvå ° C 2 min/kbp (så under några få plasmider 7,5 min) 20 fem cykler 48 ° C, inte 10 min verktygs -DNA på gel (0,8%) Jag har ingen aning om hur det kommer att utgöra. > sd arv1 codng
Jag behöver att du utformar tre varianter
Primer -Set1 (Tm = 72. OC) –
Ett halvt dussin före д: 6 ‘CAATATACGAAAGCATATCGGCcCTTGTTACTGAATACCAACAATCC 3’
Tillbaka: 5 ‘GGATTGTTGGTATTCAGTAACAAGgGCCGATATGCTTTCGTATTG 3CT
Framåt: 5 ‘CGGTATACGCCTAACAAATTcTGGGAAACCTGTAGATGC 3’TGGGAAACCTGTAGATGC 3’TGTGAT
Bakåt: 5 ‘GCATGATGAGGATGACT> En gång
tyvärr versaler är en bestämd mutationspunkt
Om du får fler inspirerande idéer, berätta det!
Vilket mutagen kan användas för informationsplatsstyrd mutagenes?
DNA -polymeras: Detta innebär att 5′- till 3′-exonukleaser inte verkar här. DNA-polymeraser så som Pfu, Vent, förutom Phusion, erbjuder en högre amplifieringshastighet vid platsriktad mutagenes. Taq DNA-polymeras används endast i de flesta PCR-baserade metoder för förlängda mutationer.
Hur introduceras de önskade mutationerna senast riktad mutagenes?
Sammanfattning inklusive platsinriktad mutagenes Snabbt kan punktmutationer enkelt införas fast i plazmider, som genererar primers (med önskad mutation) och skapar användning av ett PCR -protokoll som förstärker hela temaplasmiden. I själva verket isoleras plasmider från alla de resulterande kolonierna och kontrolleras sedan för den tänkta modifieringen.
Site Directed Mutagenesis Troubleshooting No Mutation
Rozwiazywanie Problemow Z Mutageneza Ukierunkowana Na Miejsce Bez Mutacji
Mutagenesi Sito Diretta Risoluzione Dei Problemi Nessuna Mutazione
Site Directed Mutagenese Probleemoplossing Geen Mutatie
사이트 지정 돌연변이 발생 문제 해결 돌연변이 없음
Ustranenie Problem S Sajt Napravlennym Mutagenezom Bez Mutacij
Mutagenese Dirigida Ao Local Sem Solucao De Mutacao
Mutagenesis Dirigida Al Sitio Resolucion De Problemas Sin Mutacion
Mutagenese Dirigee Depannage Aucune Mutation
Ortsgerichtete Mutagenese Fehlerbehebung Keine Mutation
